原标题：双清平化方对代谢综合征大鼠骨骼肌自噬通路蛋白表达的影响

代谢综合征（metabolic syndrome，MS）是肥胖并伴有高血压及糖、脂代谢异常症候群，是心脑血管病的主要危险因素[1-3]。目前，我国老年人群中MS患病率已达25.5%，预计到2035年成人MS患病率可达35%～50% [4-5] 。因此，预防和治疗MS已成为医学研究的热点。胰岛素抵抗是MS发病的重要病理基础，而骨骼肌是胰岛素抵抗的重要靶组织。研究显示自噬与胰岛素抵抗密切相关，并参与了胰岛素抵抗的发生与进展。

现代医学的治疗方案尚停留在对症治疗以及延缓疾病进展的阶段，纠正代谢紊乱是治疗MS的研究方向。根据临床MS病证分析，肝胃火旺、痰浊不化为其常见病证，本课题组依据临床经验和药理实验总结出防治该证的双清平化方[6]。推测是否通过调节骨骼肌自噬，进而改善骨骼肌能量的稳态及胰岛素抵抗。为此，本实验构建MS大鼠模型，以不同剂量双清平化方进行干预，观察其对模型大鼠Lee’s指数、血压、血糖、血脂、糖化血红蛋白（glycated hemoglobin，GHb）、胰岛素（insulin，INS）、总胆固醇（total cholesterol，TC）、三酰甘油（triglyceride，TG）、低密度脂蛋白胆固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）的影响及骨骼肌组织病理形态学、骨骼肌组织中哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）、自噬效应蛋白1（Beclin1）、微管相关蛋白1轻链3（microtubule-associated protein1 light chain 3，LC3）蛋白表达的变化，探讨双清平化方改善MS大鼠糖脂代谢的作用机制，为其治疗MS提供实验依据。

1材料

1.1动物

SPF级SD雄性大鼠60只，4周龄，体质量（146.1±2.6）g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，许可证号SCXK（京）2019-0008，合格证号1103221911004286。饲养于华北理工大学10000级屏障环境动物实验室，实验设施合格证编号SYXK（冀）2020-007，室温22～24 ℃，相对湿度45%，光暗周期（12 h/12 h）。动物实验经华北理工大学实验动物伦理委员会审批（批准号LAEC-NCST-2020156）。

1.2药材

双清平化方组成为桑叶、蒲公英、生山楂、决明子、莱菔子、夏枯草、葛根、海藻粉、炒荞麦粉、珍珠粉。蒲公英购自河北省农林科学院滨海农业研究所，其余药材均购自于唐山市北京同仁堂药店，经华北理工大学田春雨教授鉴定桑叶为桑科植物桑Morus albaL.的干燥叶，蒲公英为菊科植物碱地蒲公英Taraxacum borealisinense Kitam .的干燥全草，生山楂为蔷薇科植物山楂Crateagus pinnatifidaBge .的干燥成熟果实，决明子为豆科植物决明Cassia toraL.的干燥成熟种子，莱菔子为十字花科植物萝卜Raphanus sativus L.的干燥成熟种子，夏枯草为唇形科植物夏枯草Prunella vulgarisL.的干燥果穗，葛根为豆科植物野葛Pueraria lobate(Wild.) Ohwi的干燥根，海藻为马尾藻科植物海蒿子Sargassum pallidum(Tum.) C. Ag.的干燥藻体，炒荞麦为蓼科植物荞麦Fagopyrum esculentumMoench.的干燥成熟种子，珍珠粉为珍珠贝科动物马氏珍珠贝Pteria martensii(Dunker)受刺激形成的珍珠粉末。

1.3药品与试剂

普通饲料[豫饲证（2008）25540]购自北京环宇中科生物科技有限公司；高脂饲料（批号SN10141）购自赛诺生物科技有限公司；对照品绿原酸（批号110753-202018）、咖啡酸（批号110885-201703）、菊苣酸（批号111752-202104）、葛根素（批号110752-201816）均购自中国食品药品检定研究院，质量分数均为98%；盐酸二甲双胍片（批号190401）购自中美上海施贵宝制药有限公司；组织固定液（批号MA0192）购自大连美仑生物科技有限公司；GHb试剂盒（批号20191008）、INS试剂盒（批号H203-1-2）、TC试剂盒（批号：20190930）、TG试剂盒（批号20190929）、LDL-C试剂盒（批号20190929）、HDL-C试剂盒（批号20190930）均购自南京建成生物工程研究所；N-硝基- L - 精氨酸甲酯（N-nitro- L -arginine methyl ester ，L-NAME，批号A7088-25）购自APE BIO Technology LLC公司；链脲佐菌素（streptozotocin，STZ，批号BJBAG2001）购自北京博爱港生物技术有限公司；BCA蛋白定量试剂盒（批号A91041）购自杭州联科生物技术股份有限公司；快速十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝胶制备试剂盒（批号ZD304）购自北京庄盟国际生物基因科技有限公司；β-actin抗体（批号9100026001）购自武汉爱博泰克生物科技有限公司；mTOR抗体（批号20657-1-AP）、Beclin1抗体（批号11306-1-AP）、LC3抗体（批号14600-1-AP）均购自武汉三鹰生物技术有限公司；HRP标记的山羊抗兔IgG抗体（批号10226187）购自美国Seracare公司。

1.4仪器

1OH55IH1538型稳益血糖仪（三诺生物传感股份有限公司）；TP1020型组织脱水机、RM2245型组织切片机（德国Leica公司）；电泳仪、成像系统ChemiDocTM CXRS＋System（美国Bio-Rad公司）；M200PR0型酶标仪（瑞士Tecan公司）；正置显微镜（日本Olympus公司）；LC-20A型液相色谱仪（日本岛津公司）。

2 方法

2.1 双清平化方的制备

取桑叶10 g、蒲公英30 g、生山楂20 g、决明子10 g、莱菔子10 g、夏枯草20 g、葛根20 g、海藻粉3 g、炒荞麦粉30 g、珍珠粉1 g，打成粗末，加6倍量的水浸泡1 h后，煎煮1.5 h，滤过，药渣再加入4倍量的水煎煮1.5 h，滤过，混合2次水煎液，低温高速离心2 h，取上清液，于100 ℃的水浴锅中浓缩。经高效液相色谱检测，主要含葛根素0.30%、绿原酸0.034%、咖啡酸0.0096%和菊苣酸0.065%。

2.2造模、分组及给药

60只雄性SD大鼠给予普通饲料适应性饲养1周后，随机分为对照组（10只）和造模组（50只），对照组给予普通饲料及纯水，造模组给予高脂饲料及10%果糖水溶液喂养，饲养至第11周实验组大鼠ig L -NAME （20 mg/kg）2周，并于第13周ip STZ（30 mg/kg），对照组ig等体积生理盐水并ip枸橼酸钠缓冲液。实验第8、12、14周测量各组大鼠体长、体质量、腹围，并根据公式计算Lee’s指数[7]；实验第0、4、8、12、14周测量各组大鼠血压。第14周评估成模情况[7-8]，评价指标为①中心性肥胖：Lee’s指数或体质量及腰围显著变化；②高血压：收缩压或舒张压显著变化；③高血糖：11.1 mmol/L＜空腹血糖（fasting blood glucose，FBG）＜16.7 mmol/L或餐后2 h血糖（2 h postprandial glucose，PG2h）＞16.7 mmol/L。

将成模大鼠按血糖随机分为模型组、二甲双胍（0.18 g/kg）组和双清平化方低、中、高剂量（3.47、6.93、13.38 g/kg，分别相当于临床剂量的0.5、1、2倍）组，每组各10只[9]。各给药组ig相应药物，1次/d，连续8周。

2.3血清学检测

药物干预前及干预第4、8周末尾静脉采血，检测大鼠FBG及PG2h；计算葡萄糖曲线下面积（OGTT-AUC）和胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）。于药物干预第8周末，ip 10%水合氯醛-氨基甲酸乙酯（1 mL/kg）[10]，腹主动脉采血，离心后取血清，根据试剂盒说明书进行相应指标的检测。

2.4 骨骼肌组织病理变化观察

采血后立即取大鼠双侧后肢腓肠肌，于4%多聚甲醛中固定，固定完成后进行脱水、包埋、切片以及脱蜡，按苏木素-伊红（HE）染液试剂盒说明书进行HE常规染色，观察骨骼肌组织形态学变化；按Masson染液试剂盒说明书进行Masson染色，观察骨骼肌组织纤维变化。

2.5 免疫组化检测骨骼肌组织中LC3蛋白表达

取“2.4”项下脱蜡后的切片进行抗原修复，内源性过氧化氢酶阻断，滴加山羊血清封闭，滴加LC3抗体（1∶500），4 ℃孵育过夜，滴加生物素标记山羊抗兔IgG聚合物，滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，DAB显色，流水冲洗，苏木素染色，流水冲洗，1%盐酸乙醇分化液分化，梯度脱水，二甲苯透明，封片，于显微镜下观察。

2.6 Western blotting检测骨骼肌组织中mTOR、Beclin1和LC3蛋白表达

各组大鼠骨骼肌组织剪碎后，放入含蛋白酶抑制剂的裂解液，匀浆提取蛋白，采用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，蛋白样品经10% SDS-PAGE凝胶电泳，转至PVDF膜，于5%脱脂牛奶中封闭2 h，分别加入mTOR（1∶1000）、p-mTOR（1∶1000）、Beclin1（1∶2000）、LC3（1∶1000）抗体，4 ℃孵育过夜，TBST洗涤，加入山羊抗兔二抗（1∶5000），摇床孵育2 h，TBST洗涤，进行凝胶成像分析。

2.7 统计学方法

结果采用Graphpad prism 8.0软件进行分析，采用单因素方差分析进行多组间比较，先进行方差齐性检验，方差齐进行两两比较，若方差不齐则采用Brown-Forsythe和Welch方差分析。

3结果

3.1 MS 大鼠成模体长、体质量、腹围、Lee’s指数和血压测定

如图1所示，大鼠饲养4周后体长、体质量、腹围及Lee’s指数均呈现出增长趋势，饲养8周后模型组大鼠体质量、腹围、Lee’s指数与对照组相比均具有统计学差异（P＜0.05），饲养12、14周后模型组大鼠体长与对照组相比具有统计学差异（P＜0.05），模型组大鼠在造模阶段收缩压和舒张压从12周开始至14周明显升高（P＜0.01）。

3.2 双清平化方对MS大鼠FBG和PG2h的影响

如图2所示，与对照组比较，模型组大鼠FBG和PG2h均显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，给药4周后，二甲双胍组和双清平化方高剂量组大鼠FBG显著降低（P＜0.01），二甲双胍组和双清平化方中、高剂量组PG2h显著降低（P＜0.05、0.01）；给药8周后，二甲双胍组和双清平化方中、高剂量组FBG和PG2h均明显降低（P＜0.05、0.01）。

3.3双清平化方对MS大鼠OGTT-AUC、INS、HOMA-IR及GHb的影响

如图3所示，与对照组比较，模型组大鼠OGTT-AUC、INS、HOMA-IR和GHb均明显升高（P＜0.01）；与模型组比较，给药4周后，二甲双胍组和 双清平化方中、高剂量组OGTT-AUC明显下降（P＜0.05、0.01）；给药8周后，二甲双胍组和双清平化方中、高剂量组OGTT-AUC和HOMA-IR明显下降（P＜0.05、0.01），二甲双胍组和双清平化方高剂量组INS和GHb均明显下降（P＜0.01）。

3.4双清平化方对MS大鼠血清中TC、TG、LDL-C和HDL-C水平的影响

如图4所示，与对照组比较，模型组大鼠血清中HDL-C水平显著降低（P＜0.01），TC、TG和LDL-C水平显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，各给药组大鼠血清中HDL-C水平显著升高（P＜0.01），TC、TG和LDL-C水平均显著降低（P＜0.01）。

3.5 双清平化方对MS大鼠骨骼肌组织病理变化的影响

如图5所示，腓肠肌HE染色后，光镜下可见细胞核为蓝色，细胞质、肌纤维、胶原纤维和红细胞呈深浅不一的红色。对照组大鼠骨骼肌肌纤维排列整齐、胞质均匀，细胞核排列正常、形态规则；模型组大鼠骨骼肌纤维排列疏松紊乱，胞质不匀，细胞核增多并出现核内移，见少量炎细胞浸润；与模型组比较，双清平化方低、中剂量组肌纤维排列有所好转，细胞核增多，核内移减少，炎细胞浸润明显改善；二甲双胍组和双清平化方高剂量组纤维排列相对整齐，胞质较为均匀，细胞核形态有所好转，细胞核及核内移减少，未见炎细胞浸润。

Masson染色结果显示，对照组大鼠腓肠肌结构完整，肌纤维排列整齐且形态规则，未见明显萎缩，肌纤维间胶原纤维较少；模型组出现增生的结缔组织，胶原纤维逐渐增多且肌纤维间距因胶原纤维的增生而变宽；与模型组比较，双清平化方低剂量组胶原纤维减少；双清平化方中剂量组肌纤维间距缩短，结缔组织和胶原纤维减少；二甲双胍组和双清平化方高剂量组肌纤维形态较规则，纤维间距缩短，胶原纤维减少，未见增生的结缔组织。

3.6免疫组化法检测MS大鼠骨骼肌组织中LC3蛋白表达

如图6所示，与对照组比较，模型组大鼠骨骼肌组织中LC3蛋白阳性表达显著降低（P＜0.01）；与模型组比较，各给药组大鼠骨骼肌组织中LC3蛋白阳性表达均显著升高（P＜0.01）。

3.7 Western blotting 检测MS大鼠骨骼肌组织中mTOR、Beclin1和LC3蛋白表达

如图7所示，与对照组比较，模型组大鼠骨骼肌组织中p-mTOR蛋白表达水平显著升高（P＜0.01），Beclin1和LC3蛋白表达水平显著降低（P＜0.01）；与模型组比较，双清平化方高剂量组大鼠骨骼肌组织中p-mTOR蛋白表达水平显著降低（P＜0.01），Beclin1和LC3蛋白表达水平均显著升高（P＜0.01）。

4 讨论

自噬异常可通过内质网应激、氧化应激、促炎症信号途径等导致胰岛素抵抗的发生[11]。骨骼肌是机体葡萄糖、脂质摄取和利用的主要部位，约70%的葡萄糖通过胰岛素依赖的方式被骨骼肌摄取利用，同时骨骼肌也是发生胰岛素抵抗的重要靶组织[12]。研究发现，2型糖尿病患者骨骼肌内细胞器发生重构、外膜细胞退化及凋亡、肌膜下线粒体减少、肌细胞内脂质沉积等，在临床上表现为胰岛素抵抗，而自噬异常可能是主要原因之一[13]。因此，探索MS骨骼肌胰岛素抵抗与自噬关系并指导药物治疗研究具有重要学术价值。改善胰岛素抵抗是治疗和预防MS的重要策略，从调节自噬途径研究中药改善胰岛素抵抗也是一个新的研究方向。骨骼肌自噬对血糖、血脂比较敏感，高糖、高脂可激活mTOR诱导的自噬活性降低，表现为自噬体形成的标志物LC3II的表达减少[14]；Bloemberg等[15]研究发现，骨骼肌细胞mTOR活性升高可抑制细胞自噬信号通路，参与了MS的发病。mTOR、Beclin1和LC3是自噬通路中主要标志物，可用于评价组织细胞自噬水平[16]。mTOR是负性调节自噬的重要信号，mTOR被抑制时可诱导自噬的发生[17]；Beclin1又名Atg6，作为自噬通路上的一个平台蛋白，通过与磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）形成新复合物来调节其他ATG蛋白在自噬前体结构中定位，进而促进自噬体膜的形成并调节自噬活性[18]；LC3是定位在双层膜和自噬体的特异性信号蛋白，可剪切为LC3Ⅰ和LC3II 2种同源物，其中LC3II作为脂质化表达于自噬体膜上，其含量和自噬泡的数量可以反映组织的自噬水平[19-20]。为此，通过观察药物对mTOR、Beclin1和LC3等主要标志物表达的影响及对HOMA-IR、糖脂代谢指标的变化，可进一步判断自噬与胰岛素抵抗的关系及药物对自噬的调节作用。

中医没有MS病名，就其临床特征与中医脾瘅相类，根据《黄帝内经》“肥者令人内热，甘者令人中满”的发病机制，结合临床证候分析发现MS患者嗜食肥甘厚味、精神压力大，形体肥胖且肝阳亢盛者居多，病机特点为肝胃火旺、气机失畅、痰浊不化[12]。针对病机结合本课题组多年从肝胃郁热治疗MS经验，选择了药食同源的中药组成双清平化方。方中夏枯草、蒲公英清肝胃郁热为君药，桑叶、珍珠粉、决明子、生山楂、莱菔子、海藻粉、炒荞麦粉助主药平肝清胃化浊为臣药，葛根升阳、生津为佐使药，全方清肝胃郁热、理气化浊、升降有序。中药药理研究发现，蒲公英、桑叶、葛根可有效改善胰岛素抵抗[21-22]；夏枯草、草决明、山楂、莱菔子等可有效调节血脂、降血压等，通过理论分析全方配伍具有MS中医病机针对性及调节糖脂代谢、改善胰岛素抵抗的药理针对性，并且配方均由药食同源中药组成，临床应用具有良好的顺应性。为此，本研究通过考察双清平化方对MS大鼠糖脂代谢及对骨骼肌自噬信号蛋白表达的影响，评价其药理效应并初步探究其对骨骼肌自噬及胰岛素抵抗的作用机制。

本研究参照文献方法[7-8]制备MS模型，结果显示模型组大鼠体长、体质量、腹围、Lee’s指数、FBG、PG2h、OGTT-AUC、GHb、HOMA-IR及血脂水平与对照组相比均明显升高，表明MS大鼠建模成功。双清平化方干预后可降低大鼠FBG、PG2h、OGTT-AUC、GHb、HOMA-IR及血脂水平，表明双清平化方对MS具有调节作用并改善胰岛素抵抗。通过免疫组化和Western blotting实验发现，模型组大鼠骨骼肌组织中mTOR蛋白表达上调，Beclin1和LC3蛋白表达下调，骨骼肌出现纤维排列疏松紊乱，胞质不匀，细胞核增多、核内移及少量炎细胞浸润现象，由此表明，高脂高糖诱导的MS模型大鼠骨骼肌存在自噬抑制及炎症激活现象。双清平化方组大鼠骨骼肌组织中mTOR蛋白表达下调，Beclin1和LC3蛋白表达上调，骨骼肌病理具有一定的改善，说明双清平化方可调节MS大鼠骨骼肌自噬信号蛋白的表达，促进高脂高糖环境下骨骼肌自噬，对于保护骨骼肌的自身稳态是有益的。

综上所述，双清平化方能够有效改善MS大鼠糖、脂代谢、胰岛素抵抗及骨骼肌的自身稳态，其作用机制可能与下调mTOR、上调Beclin1和LC3的蛋白表达，调节骨骼肌自噬水平有关。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

参考文献（略）

来 源：付文浩，田春雨，喇孝瑾，张国伟，张 敏，王瑶瑶，陈瑞军，王秀萍，李继安．双清平化方对代谢综合征大鼠骨骼肌自噬通路蛋白表达的影响 [J]. 中草药, 2022, 53(19): 6108-6116 .返回搜狐，查看更多

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